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      實時無標記動力學檢測新技術

      作者: 點擊:901 發布時間:2022-03-11

      現代生物學、醫學及轉化醫學、藥物學等研究中,隨著功能基因組研究的深入,生物大小分子的生物學功能研究占據著非常重要的地位;生物大小分子的相互作用分析成為目前分子功能學研究中不可缺少的重要手段,因此一個好的分子互作研究工具,無疑將對我們的科研起到極大的促進作用。目前研究分子互作的檢測技術層出不窮,從傳統的終點法ELISA、Co-IP 、Western Blot雜交檢測到近年迅速火熱的實時無標記的分子互作系統。無標記技術通常將蛋白質受體分子固定在傳感器表面,然后注入配體(稱為分析物)使其流過傳感器。在特定的締合時間后(由受體結合位點的飽和度決定),將不包含配體的溶液通過流通池注入以解離受體-配體復合物。受體和配體的結合和解離的變化將轉化為光的干涉圖案。這些變化基于與表面受體與配體分子結合的數量,并以傳感圖表示,從中可以計算出動力學締合常數(kon)和解離常數(koff),以及Kd(圖1

       


                                   圖1

      相對其他只能做出終點檢測的如Pull-down檢測技術,無標記技術讓研究者可以定量分析生物分子間的相互作用 Kon, Koff 和KD值,對分子間相互作用研究提供了更深入的分析。因此,無標記技術在生命科學研究中的作用越來越重要,且在很多醫藥及醫學研究中頗受關注。那么今天推薦給大家的就是基于GCIGrating-Coupled Interferometry光柵耦合干涉)技術原理的一款設備WAVE delta,現在就帶大家來了解這款性價比超高的黑馬設備。




      技術原理

      與經典的SPR技術相比,GCI巧妙的利用波導技術的原理,將光路延伸至整個傳感器表面。如圖2,當配體(分析物)與固定在傳感器表面的受體蛋白相互作用時,逝場會經歷特征性的相位延遲,將參考波和檢測光波耦合到同一波導中干涉并產生信號[1],從而消除了由光學器件的熱/機械位移引起的漂移,GCI技術極大地提高了檢測信號的穩定性,每個漸逝波都探測到了表面的相互作用,該技術已經由Creoptix AG(瑞士)開發。3,SPR技術中的每個漸逝波通常覆蓋約100 nm直徑的表面積,而GCI中的漸逝波覆蓋整個傳感器表面約2 mm長度,從而探測出比SPR更多的相互作用[2]。GCI儀器的高靈敏度使它們能夠以低響應的解析動力學,從而使研究人員能夠研究分子量比非常大(例如,數百個kDa固定的配體與200 Da的小分子分析物)分子之間的結合相互作用??梢詼y定低活性的配體和低密度的表面受體,與SPR Biocore儀器不同,由Creoptix AG設計的GCI在實際設備中既沒有微流體通道也沒有微閥。而是將微流體內置到一次性芯片中。這使得GCI能夠檢測粗樣品(例如,細胞培養基,未純化的細胞裂解物,脂質囊泡等),并通過光學生物傳感器(可檢測親和力從低pM到數十mM)擴展動力學的測量范圍。

       

        

      技術特點

      1.無與倫比的靈敏度

      對于無標記技術,展現靈敏度的方式是看信號強度,而信號強度取決于配體和分析物的分子量比以及配體的固定水平。當配體和分析物的分子量比超過300時,無論如何提高配體固定水平,傳統的無標記技術由于器原理的局限性都無法檢測到分子間的相互作用,而GCI憑借其超高的靈敏度可以在不僅在分子量比大于300的正常固定水平下可以得到穩定的信號,且在配體低固定水平也能夠準確表征其動力學信息。

       

      4

       

      如圖4,配體和分析物的分子量比為370,(圖4左)配體固定水平為2775pg/mm2 (1pg/mm2=1RU),11結合的理論信號強度為7.5(理論值=1/分子量比*固定水平),實得信號值約為5.而傳統的SPR技術無法表征分子量比超過300的動力學信息。這還不是GCI的極限,繼續減少配體固定水平(圖4右)到835RU,可以看到即使信號強度低于1RU,GCI得到的信息依然準確,表現出GCI超高的靈敏度與強大的穩定性。

      繼續增加分子量比直至1000?。▓D5),GCI依然可以表征其動力學!

       


      5

      2.超高時間分辨率

      相比于傳統的終點法ELISA、Co-IP 、Western Blot,無標記技術不僅可以檢測KD,更重要的是可以給研究者提供動力學信息(結合和解離常數),而解離常數更是其重中之重。但對于一些(快上快下)的分子間動力學過程,其解離常數小于1s-1,現有的無標記技術很難準確表征,而GCI技術目前可以檢測0.1s內分子間作用變化,表征解離速率小于10s-1的分子間相互作用。如圖6

      6

      3.創新性的芯片設計(維護成本極低)

         目前市場的主流的SPR品牌Biacore,光路系統相對復雜,維護成本比較高(單是流路管堵塞就需花費十幾萬元每年,而流路管道又特別細稍微粘稠樣本就容易堵塞),儀器操作復雜且價格較高,需要專人保養。而Creoptix不僅創新性的提高的靈敏度和時間分辨率,且創新性的將微流路外置在芯片中,無需定期更換微流路,日常維護每年僅消耗100mLPBS,支持全血清,全血漿檢測,無需擔心堵塞!兼容48,96,384板任意組合,120h無人值守運行。

       


      4.更廣泛的應用范圍

      得益于WAVE delta的靈敏度,時間分辨率和微流路外置的創新性提升,使科學家們可以做以前做不到的事情,看到以前到不到的信息。

       

      7:固定膜蛋白(整個膜)的動力學表征




      8VLPs的動力學表征(無需反轉配體和樣品)


      9ADA定量(檢測下限極低)

        

      WAVE delta的應用范圍和相關參數

      分析領域 分子相互作用模式的研究;動力學常數的測定;親和常數測定,濃度的測量及構象變化的速率等。 生命科學研究領域 蛋白質組學研究、癌癥研究、新藥研發、信號傳遞、分子識別、熱力學分析、免疫調節、免疫測定、疫苗開發、瞬時結合、配體垂釣、結合特異性、結構與功能的關系及酶反應等。分析樣品類型 :小分子化合物、多肽、蛋白質、寡核苷酸、寡聚糖到類脂、脂質體,噬菌體、病毒樣顆粒和細胞等。

       

       

      參數配置

      流通池(通道)數量: 4

      噪聲(RMS)<0.01 pg/mm 1 pg/mm 2=1RU

      漂移 <0.3 pg/mm 2 /min

      讀取頻率 1 Hz, 10 Hz or 40 Hz

      分子量:無限制

      結合常數范圍: ka = 10 3 —10 7 M -1 s -1

      解離常數范圍: kd = 10 -510 s -1

      溫控范圍 WAVEdelta: 4°C - 45°C (max 20°C below ambient)   

      微流路:整合到芯片中

      脫氣裝置:內置

      流速: 0—400ml/min

      樣品容量:兩塊48(96,384)孔板

      自動化:120h無人值守運行

      進樣量:20-425uL(普遍100ul

      緩沖液:自動轉換 4 buffers

      參考文獻:

      [1] Pedro J.S(2020)In vitro analytical approaches to study plant ligand-receptor interactions. American Society of Plant Biologists. 2:1687-1712

      [2] Lukosz W (1991) Principles and sensitivities of integrated optical and surface plasmon sensors for direct affinity sensing and immunosensing. Biosens Bioelectron 6: 215–225


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